【摘要】糖尿病视网膜病变(DR)是糖尿病的严重微血管并发症之一，可导致视网膜不可逆损伤和严重视力损害。熊去氧胆酸(UDCA)及其衍生物牛磺熊去氧胆酸(TUDCA)作为亲水胆汁酸，具有抗凋亡、抗炎和抗氧化等多重细胞保护作用，近年来在DR的防治研究中展现出潜在的应用前景。本文综述了UDCA/TUDCA在高糖环境下对视网膜神经血管单元的保护作用及其分子机制。研究表明，UDCA/TUDCA能够通过抑制线粒体依赖的细胞凋亡通路、JNK/AP-1信号通路等，保护视网膜神经元免受高糖诱导的损伤；通过抑制内质网应激和减少血管渗漏，维持视网膜血管内皮细胞和周细胞的完整性；通过下调炎症因子表达和抑制小胶质细胞活化，减轻视网膜的炎症反应。此外，UDCA/TUDCA通过结合视网膜细胞上的胆汁酸受体(如TGR5等)，激活相关信号通路，发挥其保护作用。UDCA/TUDCA在DR治疗中展现出广阔的应用前景，未来研究需进一步探索其最佳给药途径和剂量，以期为DR的早期预防和治疗提供新的策略。
【关键词】糖尿病视网膜病变；熊去氧胆酸；牛磺熊去氧胆酸；视网膜神经血管单元；抗凋亡；抗炎；抗氧化
基金项目：国家自然科学基金(82071012)
DOI:10.3760/cma.j.cn115989-20210826-00480
糖尿病视网膜病变(diabetic retinopathy，DR)是糖尿病常见且较严重的眼部微血管并发症，最终可致盲。世界卫生组织指出，在美国和欧洲，约有15%～17%的盲是由DR造成。DR已成为西方国家工作年龄段人群严重视力丧失的主要原因[1]。根据国际糖尿病联盟公布的数据，2019年全球糖尿病患者人数约为4.63亿；糖尿病患者中DR的患病率约为22.27%；2020年DR患病人数约为1.03亿，到2045年将增加至1.61亿[2]。DR主要分为非增生性糖尿病视网膜病变(non-proliferative diabetic retinopathy，NPDR)和增生性糖尿病视网膜病变(proliferative diabetic retinopathy，PDR)。目前已知DR与高血糖导致的氧化应激、炎症、晚期糖基化终末产物(advanced glycation end-products，AGEs)积累、细胞因子异常激活、线粒体DNA破坏、周细胞丢失、神经元损伤、血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)表达升高等均相关[3]，但具体发病机制尚未完全明确。
DR的治疗手段至今仍较少，除控制血糖、治疗高血压外，玻璃体内注射抗VEGF药物和糖皮质激素类药物已被应用于糖尿病性黄斑水肿的治疗[4]；但这些治疗方法对至少一半的患者疗效不明显，且频繁注射给患者的负担较大。对于重度NPDR和PDR，全视网膜激光光凝术或玻璃体手术是主要的治疗手段，但预后均较差[5]。因此，寻找安全、低成本的药物来早期预防和控制DR的发生和发展，仍是DR治疗领域重要的研究方向。本文回顾了近期关于熊去氧胆酸(ursodeoxycholic acid，UDCA)及其衍生物牛磺熊去氧胆酸(tauroursodeoxycholic acid，TUDCA)保护高糖下视网膜组织和细胞的相关研究，并探讨其在DR临床应用的前景。
胆汁酸是胆汁的主要成分，参与脂质的乳化、吸收和消化，也调节肝葡萄糖代谢等各种代谢过程[6]。初级胆汁酸由肝脏合成，被排泄到肠道，再由肠道微生物通过化学修饰转化为次级胆汁酸，UDCA就是由初级胆汁酸中的鹅去氧胆酸在肠道中转化而来。约95%的胆汁酸在回肠中被重新吸收，剩余5%经粪便排出。经肠上皮细胞吸收的胆汁酸进入门静脉，其中约90%通过肝肠循环回到肝脏，剩下少部分进入体循环，因此在人血浆和脑脊液中均可以检测到极低浓度(ng/ml级)的胆汁酸[7]。
目前，DR被广泛认为是视网膜神经血管单元损伤性眼病[8]。视网膜神经血管单元是由神经元成分(主要包括视网膜神经节细胞、双极细胞等)、血管成分(包括视网膜血管内皮细胞和周细胞)和胶质细胞成分(包括Müller细胞、星形胶质细胞和小胶质细胞)共同组成的复合体。在这个复合体内，各细胞通过彼此之间复杂的信息交流，形成动态平衡的网络，维持血－视网膜屏障(blood-retinal barrier，BRB)的完整性，调节血流、氧气和营养物质供应，清除代谢产物，以维持视网膜的正常结构与功能[9]。在DR发生和发展过程中，高血糖会直接导致视网膜血管神经单元各成分损伤和功能紊乱。
UDCA亲水，且细胞毒性较低，目前已被广泛应用于临床[10]。由于被证实具有肝细胞保护作用，UDCA于1987年被批准上市，是目前多种胆汁淤积综合征的首选治疗药物[11]。近些年来，越来越多的研究证明UDCA和TUDCA还可用于治疗多种代谢性疾病(如糖尿病、肥胖等)以及神经退行性疾病(包括阿尔兹海默症、帕金森病、亨廷顿病和肌萎缩性侧索硬化症)等。在DR等多种眼病的动物模型实验中，UDCA和TUDCA也被证实具有保护视网膜神经血管单元各成分的作用[12]。
2.1 对高糖下视网膜神经血管单元中神经元成分的保护作用
神经细胞死亡和轴突变性常发生在DR早期，且不可再生，是DR患者视力下降的主要原因。在高血糖、AGEs、氧化应激等多种刺激下，多条可导致视网膜神经节细胞凋亡的通路被激活，包括线粒体和Caspase依赖的细胞凋亡通路、JNK/AP-1信号通路等[13]。Gaspar等[14]发现TUDCA可抑制线粒体释放高糖诱导的凋亡诱导因子(apoptosis inducing factor，AIF)，减少AIF在细胞核内积累，减少高糖诱导的氧化应激产物如蛋白质羰基和活性氧簇的产生，起到对神经细胞的保护作用。Oshitari等[15]证明了TUDCA可以通过抑制高糖诱导的p-c-Jun和p-JNK的表达，进而抑制JNK/AP-1信号通路，显著减少高糖诱导的大鼠视网膜神经细胞凋亡。
2.2 对高糖下视网膜神经血管单元中血管成分的保护作用
在DR动物模型实验中，许多研究发现UDCA/TUDCA能够保护视网膜血管内皮细胞和周细胞，维持视网膜血管的完整性。Chung等[16]研究发现UCDA能够抑制内质网应激，减少暴露于AGEs的人视网膜血管周细胞发生凋亡，也减少链脲佐菌素(streptozotocin，STZ)诱导的糖尿病小鼠发生视网膜血管渗漏，毛细血管密度减少以及周细胞的丢失。Wang等[17]发现TUDCA能够显著抑制高糖诱导的人视网膜微血管内皮细胞增殖，TUDCA灌胃可以显著改善STZ诱导糖尿病大鼠的视网膜病理改变。Shiraya等[18]通过注射抗血小板衍生生长因子受体-β抗体(anti-platelet derived growth factor receptor-β mAb，clone APB5)构建了视网膜周细胞丢失小鼠模型，来模拟DR早期的病理变化，发现UDCA能够减少模型小鼠视网膜血管异常扩张，保证视网膜血管完整性，改善视网膜水肿。
2.3 对高糖下视网膜神经血管单元中胶质细胞成分的保护作用
在DR早期，Müller细胞即发生肿胀，并上调VEGF的表达，加剧BRB的破坏[19]。小胶质细胞在高血糖的刺激下会通过ERK/NF-κB信号通路活化由抗炎状态转为促炎状态，释放多种炎性细胞因子，如肿瘤坏死因子-α(tumor necrosis factor-α，TNF-α)、白细胞介素-1β(interleukin-1β，IL-1β)、IL-6、IL-8和单核细胞趋化蛋白-1(monocyte chemotactic protein-1，MCP-1)等[13]。Ouyang等[20]发现UDCA可抑制STZ诱导的糖尿病小鼠视网膜小胶质细胞的活化，还能降低TNF-α、IL-1β、IL-6、细胞间黏附分子-1(intercellular adhesion molecule-1，ICAM-1)、诱导型一氧化氮合酶(inducible nitric oxide synthase，iNOS)和VEGF的表达[20]。在APB5诱导的小鼠中同样也能观察到UDCA可减少视网膜组织中炎症因子表达[18]。TUDCA也能通过降低高糖诱导的视网膜微血管内皮细胞中以及STZ诱导DR模型大鼠血浆中一氧化氮含量，抑制NF-κb通路，下调炎症因子表达[17]。
综上所述，UDCA/TUDCA主要通过抗凋亡、抗炎、抗氧化3个方面起到对多种视网膜细胞的保护作用，进而改善DR的病理进程。
UDCA/TUDCA作为次级胆汁酸，无法在视网膜细胞中自行合成，因此其是在转运体介导下，通过外周血液循环进入视网膜组织，通过结合视网膜细胞上的受体蛋白来激活信号通路，进而发挥保护作用[21]。
在已知的胆汁酸转运体中，有机阴离子转运多肽(organic anion transporting polypeptide，OATP)转运体在视网膜神经细胞和视网膜色素上皮细胞上被发现[22,23]。研究发现，OATP1A2在光感受器细胞中表达，OATP1B2在视网膜内核层和内丛状层中表达[24]。在视网膜血管内皮细胞中还发现了多药耐药的相关蛋白4转运体[25]。
胆汁酸受体包括膜受体和核受体。主要的膜受体有G蛋白偶联胆汁酸受体1(G-protein bile acid-activated receptor 1，TGR5)、鞘氨醇-1-磷酸受体2(sphingosine-1-phosphate receptor 2，S1PR2)及整合素α5β1等；主要的核受体有法尼醇X受体(farnesoid X receptor，FXR)、孕烷X受体及维生素D受体等[26]。目前，有研究已发现视网膜组织中存在多种胆汁酸受体，如大鼠视网膜内核层，小鼠及人的视网膜血管内皮细胞中均存在S1PR2，人视网膜血管内皮细胞和星形胶质细胞中存在整合素α5β1，在视网膜色素上皮细胞中存在孕烷X受体，维生素D受体也在视网膜组织中有表达[7,27,28,29,30,31,32]。对于FXR，目前研究仅发现其在角膜和睫状体上皮细胞的细胞核内存在，尚未有研究报道FXR在视网膜细胞中表达[33]。在视网膜神经节细胞层和微血管内皮细胞中都发现了TGR5的存在[34,35]。
Beli等[34]在db/db小鼠动物模型研究中发现，间歇性禁食可以通过改变肠道微生物的组成，进而改变胆汁酸的代谢，使得TUDCA的含量增加，并激活视网膜中的TGR5受体，抑制DR的进程。TGR5的激活可以通过抑制RhoA/ROCK通路依赖的肌动蛋白重塑，改善糖尿病大鼠视网膜微血管功能障碍，抑制TNF-α引起的视网膜微血管内皮细胞增殖、迁移和通透性改变等作用，也可以通过调节PKCδ/Drp1-HK2通路抑制线粒体分裂和增强线粒体吞噬，改善视网膜微血管内皮细胞的凋亡[35,36]。TGR5的激活还能够抑制Müller细胞中线粒体Ca 2+超载，改善线粒体功能障碍并减轻cGAS-STING途径介导的神经炎症[37]。此外，TUDCA与小胶质细胞表面的TGR5结合，能够引起环磷酸腺苷的升高，进而起到抗炎作用[38]。
熊胆汁在中医中已有3 000余年的应用历史，古代中医文献中记载了其诸多功效，主要包括解毒肝脏、溶解胆结石、止惊厥等。值得一提的是，其在治疗眼部疾病、改善视力方面有显著疗效[39]。《本草纲目》等中医古籍中记载熊胆有"明目退翳"的功效，可用于治疗"目赤肿痛，畏光流泪，目生障翳"等症状。2020年修订的《中国药典》收录了以熊胆胆汁为主要成分的复方熊胆滴眼液，用于治疗急性细菌性结膜炎、流行性角结膜炎等[40]。迄今，在ClinicalTrials.gov上登记有205项有关UDCA的临床试验和37项有关TUDCA的临床试验。目前尚无UDCA/TUDCA直接应用于DR的临床研究报道。
UDCA应用于DR治疗的前景十分广阔。首先，由于UDCA是已获得美国食品药品监督管理局批准用于治疗多种肝胆疾病的药物，对人体的安全性和耐受性良好，不良反应少[41]。其次，UDCA可抗氧化、抗凋亡、抗炎等，对于DR的多种病理过程都有潜在的治疗作用。一项关于UDCA作为孔源性视网膜脱离辅助治疗的Ⅰ期临床实验(NCT02841306；法国洛桑大学)证实了口服UDCA后，UDCA可通过BRB进入视网膜组织，在视网膜下液中可达到有效浓度，显著保护了大鼠视网膜的光感受器免于凋亡和坏死[42]。BRB的破坏程度是影响UDCA眼部生物利用度的主要因素。对于DR患者来说，BRB的破坏可增加UDCA/TUDCA的眼部生物利用度，因此推测UDCA/TUDCA对于DR的治疗也具有潜在的临床应用前景。
然而，将UDCA用于治疗DR仍存在很多挑战，需全面权衡其疗效以及可能带来的不良反应，以获得患者的利益最大化。将UDCA/TUDCA转化应用于眼科疾病临床治疗的挑战之一是如何将这种药物输送到眼睛。口服全身给药的方式较为方便，但容易出现全身不良反应。在既往关于肌萎缩性侧索硬化症治疗的一项临床试验中发现，口服UDCA剂量低于每天50 mg/kg时，患者仅有轻微的腹泻等胃肠道不良反应，未发现其他不适和对于神经系统的毒害作用[43]。但在DR大鼠模型中能够降低血浆一氧化氮从而起到视网膜保护作用的有效UCDA喂养剂量对人类来说非常高，达到了500 mg/kg[44]。过高剂量摄入UDCA有可能会造成肝毒性等严重不良反应[45]。此外，BRB破坏程度不同，口服的药物被真正转运到视网膜组织中的量也不同。为此，Fernández-Sánchez等[46]开发了TUDCA缓释制剂微球，并每月向在P23H光感受器退化大鼠模型玻璃体内注射1次微球，与每周全身注射TUDCA相比，前者表现出更好的功能保存效果。但玻璃体腔注射是一种侵入性手段，可能会诱发排异反应和眼内炎症等严重不良反应[47]。因此，探索并明确适宜的给药方式和给药剂量，是将UDCA/TUDCA真正应用于DR临床治疗的先决条件。
根据目前已有的研究，在细胞和动物模型层面，可以明确UDCA/TUDCA对于高糖下视网膜具有保护作用。这种保护作用主要是通过抗凋亡(包括抑制AIF从线粒体释放，抑制p-c-Jun和p-JNK的表达，抑制内质网应激)、抗炎(包括下调ICAM-1、诱导型一氧化氮合酶、NF-κB p65、VEGF、MCP-1、TNF-α等炎症介质和炎症因子，抑制小胶质细胞等免疫细胞的活化)和抗氧化(降低氧化应激产物的产生)来实现。因此，UDCA/TUDCA对于DR的治疗具有潜在的临床应用前景，但真正将其应用于DR临床防治，仍需进一步探索适宜的给药方式和给药剂量。